راهنمای انتخاب آنتی بادی در تحقیقات

آنتی بادی چیست؟

آنتی بادی (Antibody) یا ایمونوگلوبولین، یک پروتئین اتصال دهنده است که به صورت اختصاصی به یک هدف مشخص به نام آنتی ژن متصل میشود. در تحقیقات زیستی و پزشکی، همین اتصال اختصاصی باعث شده آنتی بادی از یک مولکول ایمنی به یک ابزار دقیق آزمایشگاهی تبدیل شود؛ ابزاری که میتواند وجود یک پروتئین را تایید کند، مقدار نسبی آن را نشان دهد، محل حضورش را در سلول یا بافت مشخص کند و حتی تغییرات عملکردی آن را در شرایط مختلف آشکار کند.

در عمل، بسیاری از پروژه های تحقیقاتی به چند سوال کلیدی ختم میشوند:
آیا پروتئین هدف وجود دارد؟ چقدر وجود دارد؟ کجا بیان میشود؟ و در کدام جمعیت سلولی یا کدام بخش بافت دیده میشود؟
آنتی بادی دقیقا برای پاسخ دادن به همین سوال ها وارد میدان میشود و پایه بسیاری از تکنیک های رایج است.

آنتی بادی چه نقشی در تکنیک های رایج دارد؟

آنتی بادی در آزمایشگاه مثل یک ردیاب عمل میکند که پروتئین هدف را پیدا میکند و بعد آن اتصال به یک سیگنال قابل مشاهده یا قابل اندازه گیری تبدیل میشود. این تبدیل سیگنال بسته به تکنیک متفاوت است:

• در وسترن بلات، آنتی بادی پروتئین جدا شده روی ژل را تشخیص میدهد و سیگنال آن معمولا با HRP یا فلورسانس آشکار میشود. به همین دلیل انتخاب آنتی بادی مناسب و خرید آنتی بادی وسترن بلات مستقیما روی شفافیت باندها و قابل تفسیر بودن نتیجه اثر دارد.
• در فلوسایتومتری، آنتی بادی معمولا فلورسانت است و به مارکرهای سطحی یا داخل سلولی میچسبد تا بتوانید جمعیت های سلولی را تفکیک کنید. بنابراین خرید آنتی بادی فلوسایتومتری یعنی انتخاب درست فلوروکروم، سازگاری با فیکساسیون، و کنترل های دقیق.
• در ایمونوهیستوشیمی، آنتی بادی باید پروتئین را در بافت فیکس شده پیدا کند و نتیجه باید با حداقل بک گراند و بیشترین اختصاصیت دیده شود. پس خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی وابسته به مواردی مثل نوع فیکساسیون، بازیابی آنتی ژن و تجربه ولیدیشن آن آنتی بادی است.

چرا با وجود روش های مولکولی، آنتی بادی همچنان ضروری است؟

روش های مولکولی مثل PCR و qPCR عمدتا RNA را اندازه میگیرند، اما بسیاری از نتیجه گیری های زیستی در نهایت باید روی سطح پروتئین تایید شوند. چون:

• مقدار RNA همیشه معادل مقدار پروتئین نیست و ترجمه و تخریب پروتئین میتواند نتیجه را تغییر دهد.
• تغییرات عملکردی پروتئین مثل فسفریلاسیون یا برش پروتئینی با qPCR دیده نمیشود.
• محل قرارگیری پروتئین در سلول یا بافت (هسته، غشا، سیتوپلاسم) برای بسیاری از فرضیه ها تعیین کننده است و اینجا آنتی بادی ابزار اصلی است.

به همین دلیل، حتی پروژه هایی که با سنجش های ژنی شروع میشوند، برای اثبات نهایی یا ارائه داده قابل انتشار معمولا به داده های مبتنی بر آنتی بادی نیاز دارند.

آنتی بادی اولیه و ثانویه یعنی چه و چرا در خرید اهمیت دارد؟

در اکثر تکنیک ها دو نوع آنتی بادی با هم استفاده میشوند:

• آنتی بادی اولیه که مستقیم به پروتئین هدف متصل میشود.
• آنتی بادی ثانویه که به بخش Fc آنتی بادی اولیه میچسبد و معمولا کانژوگه شده است (مثلا HRP یا فلوروکروم) تا سیگنال قابل مشاهده تولید شود.

در واقع، بسیاری از مشکلات رایج مثل سیگنال ضعیف یا بک گراند بالا، به انتخاب نادرست آنتی بادی ثانویه برمیگردد. بنابراین خرید آنتی بادی ثانویه یک مرحله جدا از خرید اولیه نیست، بلکه ادامه همان تصمیم است: باید گونه آنتی بادی اولیه، ایزوتایپ، و کاربرد موردنظر را دقیق بدانید تا ثانویه درست انتخاب شود.

چرا انتخاب درست آنتی بادی میتواند سرنوشت یک پروژه را عوض کند؟

در فضای واقعی آزمایشگاه، شکست بسیاری از تست ها به خاطر خود تکنیک نیست؛ به خاطر آنتی بادی نامناسب است. چند مورد رایج:

• باندهای اضافه یا غیرمنتظره در وسترن بلات به دلیل اتصال غیر اختصاصی.
• بک گراند بالا در ایمونوهیستوشیمی به دلیل ناسازگاری آنتی بادی با نمونه فیکس شده یا بازیابی آنتی ژن.
• سیگنال ضعیف در فلوسایتومتری به دلیل انتخاب نامناسب فلوروکروم یا شرایط فیکس.
• اختلاف نتایج بین دفعات آزمایش به دلیل نگهداری غلط، فریز و دیفریز مکرر یا تفاوت بچ.

پس وقتی صحبت از خرید آنتی بادی میشود، هدف فقط تهیه یک ریجنت نیست؛ هدف این است که داده نهایی قابل تکرار، قابل دفاع و قابل انتشار باشد.

ساختار آنتی بادی به زبان کاربردی

برای اینکه در خرید آنتی بادی اشتباه نکنیم، باید ساختار آنتی بادی را نه به شکل تئوری، بلکه به شکل کاربردی بشناسیم. چون خیلی از تصمیم های مهم مثل انتخاب آنتی بادی ثانویه، انتخاب کانژوگه (HRP یا فلوروکروم)، کاهش بک گراند، و حتی اینکه چرا یک آنتی بادی در وسترن بلات خوب جواب میدهد اما در ایمونوهیستوشیمی ضعیف است، مستقیم به همین ساختار برمیگردد.

آنتی بادی از دو بخش اصلی تشکیل شده است: Fab و Fc

آنتی بادی را میتوانید مثل یک مولکول Y شکل در نظر بگیرید که هر قسمت آن یک نقش مشخص دارد:

1) بخش Fab (بخش اتصال به آنتی ژن): نوک دو بازوی Y همان جایی است که آنتی بادی به هدف میچسبد. این قسمت تعیین میکند آنتی بادی دقیقا چه چیزی را میبیند. اگر Fab اختصاصیت کافی نداشته باشد، آنتی بادی به چند پروتئین میچسبد و در وسترن بلات باندهای اضافه میبینید یا در ایمونوهیستوشیمی بک گراند بالا میگیرید. بنابراین کیفیت اصلی یک آنتی بادی در همین ناحیه تعریف میشود و هنگام خرید آنتی بادی باید دنبال داده های ولیدیشن و اختصاصیت باشید، نه فقط اسم پروتئین هدف.

2) بخش Fc (بخش ثابت و قابل تشخیص): پایه Y همان Fc است. این قسمت به آنتی ژن کاری ندارد، اما برای آزمایشگاه حیاتی است چون آنتی بادی ثانویه معمولا Fc را تشخیص میدهد. یعنی وقتی شما خرید آنتی بادی ثانویه انجام میدهید، در واقع دارید یک مولکول میخرید که به Fc آنتی بادی اولیه میچسبد و سیگنال تولید میکند. به همین دلیل اگر گونه آنتی بادی اولیه را اشتباه انتخاب کنید یا ثانویه با همان گونه همخوان نباشد، کل تست عملا سیگنال نمیدهد یا بک گراند بالا میرود.

چرا ایزوتایپ ها مهم هستند؟

ایزوتایپ یعنی کلاس آنتی بادی. مهم ترین ها در تحقیقات IgG, IgM, IgA هستند، ولی در عمل بیشتر آنتی بادی های تجاری تحقیقاتی IgG هستند. ایزوتایپ چند جا اثر مستقیم دارد:

• در انتخاب آنتی بادی ثانویه: برخی ثانویه ها برای IgG طراحی شده اند و اگر آنتی بادی اولیه شما IgM باشد، ممکن است سیگنال ضعیف شود مگر اینکه ثانویه اختصاصی IgM بگیرید. پس هنگام خرید آنتی بادی ثانویه باید بدانید ایزوتایپ اولیه چیست.
• در بک گراند و اتصال غیر اختصاصی: بعضی ایزوتایپ ها بیشتر تمایل به اتصال غیر اختصاصی دارند یا در بعضی بافت ها بک گراند بیشتری ایجاد میکنند. این موضوع در خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی خیلی پررنگ است.
• در کنترل های فلوسایتومتری: در فلوسایتومتری، کنترل ایزوتایپی برای تشخیص بک گراند ناشی از Fc binding یا اتصال غیر اختصاصی استفاده میشود. اینجا هم شناخت ایزوتایپ آنتی بادی اولیه مهم است، و مستقیم به خرید آنتی بادی فلوسایتومتری و کنترل های آن وصل میشود.

آنتی بادی مونوکلونال و پلی کلونال از نظر ساختاری چه فرقی دارند؟

این تفاوت را باید از زاویه Fab نگاه کرد:

• آنتی بادی مونوکلونال یعنی همه مولکول ها یک Fab یکسان دارند و به یک اپی توپ مشخص روی آنتی ژن میچسبند. نتیجه این است که تکرارپذیری بالاتر میشود و در بسیاری از پروژه های مقاله محور، خرید آنتی بادی مونوکلونال انتخاب امن تری است. مخصوصا وقتی میخواهید یک باند مشخص در وسترن بلات یا یک سیگنال دقیق در فلوسایتومتری داشته باشید.

• آنتی بادی پلی کلونال یعنی مخلوطی از آنتی بادی ها با Fab های متفاوت دارید که به چند اپی توپ از همان آنتی ژن میچسبند. این موضوع میتواند سیگنال را قوی تر کند، ولی احتمال بک گراند و تغییرات بین بچ ها هم بالا میرود. در ایمونوهیستوشیمی گاهی پلی کلونال به دلیل سیگنال قوی مورد استفاده قرار میگیرد، اما ریسک آف تارگت را باید مدیریت کرد.

این بخش دقیقا نشان میدهد چرا در خیلی از موارد، اگر هدف شما داده تمیز و قابل تکرار است، خرید آنتی بادی مونوکلونال منطقی تر میشود، ولی در برخی شرایط پلی کلونال هم میتواند انتخاب درست باشد.

چرا یک آنتی بادی ممکن است در یک تکنیک عالی اما در تکنیک دیگر ضعیف باشد؟

چون هدف (آنتی ژن) در هر تکنیک یک شکل متفاوت دارد:

• در وسترن بلات، پروتئین معمولا دناتوره شده است. بنابراین آنتی بادی باید اپی توپ خطی را بشناسد.
• در فلوسایتومتری، پروتئین اغلب در حالت طبیعی روی سطح سلول یا داخل سلول است. پس آنتی بادی باید اپی توپ کانفورماسیونی یا ساختاری را تشخیص دهد.
• در ایمونوهیستوشیمی، فیکساسیون و پارافینه کردن میتواند اپی توپ را پنهان کند و نیاز به بازیابی آنتی ژن دارد.

پس هنگام خرید آنتی بادی وسترن بلات یا خرید آنتی بادی فلوسایتومتری یا خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی باید دقیقا ببینید همان آنتی بادی برای همان کاربرد ولیدیت شده است، نه اینکه صرفا نام پروتئین هدف روی دیتاشیت باشد.

انواع آنتی بادی از نظر منابع

وقتی برای خرید آنتی بادی اقدام میکنید، اولین تصمیم واقعی این نیست که «هدف پروتئینی چیست»، بلکه این است که آنتی بادی را از چه نوعی انتخاب کنید. چون نوع تولید آنتی بادی تعیین میکند شما با چه سطحی از اختصاصیت، تکرارپذیری، حساسیت، و ریسک آف تارگت طرف هستید. این بخش دقیقا همان جایی است که باعث میشود خرید آنتی بادی مونوکلونال در بعضی پروژه ها انتخاب طلایی باشد و در بعضی موارد هم یک پلی کلونال خوب نتیجه بهتری بدهد.

آنتی بادی پلی کلونال (Polyclonal) چیست؟

آنتی بادی پلی کلونال مجموعه ای از آنتی بادی هاست که توسط چندین کلون از سلول های B تولید میشود و هر کدام میتوانند به اپی توپ های متفاوتی از همان آنتی ژن متصل شوند. معمولا با ایمن سازی حیوان (مثل خرگوش، بز یا گوسفند) و جمع آوری سرم تولید میشود.

مزیت های پلی کلونال در تحقیقات

• سیگنال معمولا قوی تر است چون چند آنتی بادی به بخش های مختلف آنتی ژن میچسبند.
• برای اهداف با بیان کم یا نمونه هایی که آنتی ژن محدود است میتواند حساسیت بالاتری بدهد.
• در بعضی کاربردها مثل برخی انواع ایمونوهیستوشیمی، اگر اپی توپ در اثر فیکساسیون تا حدی پنهان شود، هنوز احتمال دارد یکی از اپی توپ های دیگر قابل شناسایی بماند و سیگنال حفظ شود.

محدودیت های پلی کلونال:

• تکرارپذیری بین بچ ها پایین تر است چون ترکیب آنتی بادی ها میتواند بین سری های تولید تغییر کند.
• احتمال آف تارگت و بک گراند بالاتر است، مخصوصا اگر خالص سازی و ولیدیشن دقیق انجام نشده باشد.
• اگر پروژه شما مقاله محور است و نیاز به بازتولید دقیق دارد، پلی کلونال ریسک بیشتری دارد.

آنتی بادی مونوکلونال (Monoclonal) چیست؟

آنتی بادی مونوکلونال از یک کلون سلول B منشأ میگیرد، بنابراین همه مولکول های آنتی بادی یکسان هستند و به یک اپی توپ مشخص متصل میشوند. نتیجه این است که رفتار آنتی بادی قابل پیش بینی تر و تکرارپذیرتر میشود.

چرا خرید آنتی بادی مونوکلونال در تحقیقات رایج است؟

• اختصاصیت معمولا بالاتر است و احتمال باندهای اضافه در وسترن بلات کمتر میشود.
• تکرارپذیری بین بچ ها بهتر است و برای پروژه های مقاله محور، پایان نامه و کارهای طولانی مدت انتخاب امن تری است.
• در فلوسایتومتری، کلون آنتی بادی اهمیت حیاتی دارد چون مرز جداکنندگی جمعیت ها و شدت فلورسانس به همان کلون وابسته است. اینجا تقریبا همیشه خرید آنتی بادی فلوسایتومتری با تمرکز روی کلون انجام میشود.

محدودیت های مونوکلونال

• اگر اپی توپ هدف در اثر دناتوراسیون (مثلا در وسترن بلات) یا فیکساسیون (در IHC) تغییر کند یا پنهان شود، ممکن است سیگنال به شدت افت کند، چون فقط یک اپی توپ را میبیند.
• در بعضی موارد، حساسیت نسبت به پلی کلونال کمتر است و نیاز به بهینه سازی بیشتری دارد.

آنتی بادی ریکامبیننت چیست؟

آنتی بادی ریکامبیننت با روش های مهندسی ژنتیک تولید میشود. یعنی توالی بخش های متغیر (binding site) مشخص است و در یک سیستم بیان (مثل سلول های پستانداری یا سیستم های دیگر) تولید میشود. این نوع آنتی بادی به دلیل تعریف شدن توالی، از نظر تکرارپذیری و کنترل کیفیت یک قدم جلوتر از بسیاری از مونوکلونال های کلاسیک است.

مزیت های ریکامبیننت

• تکرارپذیری بسیار بالا چون توالی ثابت است و وابسته به شرایط حیوان یا هیبریدوما نیست.
• امکان مهندسی: میتوان Fc را تغییر داد، کانژوگه را دقیق کنترل کرد یا حتی آنتی بادی را در قالب های مختلف ساخت.
• برای پروژه هایی که نیاز به استانداردسازی طولانی مدت دارند، انتخاب ایده آل است.

محدودیت ها

• قیمت معمولا بالاتر است و ممکن است در بازار همیشه دسترسی سریع نداشته باشد.
• بعضی آنتی بادی های ریکامبیننت برای همه کاربردها به اندازه کافی ولیدیت نشده اند و باید دیتاشیت دقیق بررسی شود.

انواع آنتی بادی از نظر کاربرد در تکنیک ها

این بخش جایی است که تصمیم خرید از حالت کلی خارج میشود و کاملا عملی میشود. چون یک آنتی بادی ممکن است روی دیتاشیت برای چند کاربرد ذکر شده باشد، اما در واقعیت آزمایشگاه فقط در یک تکنیک نتیجه تمیز و قابل تکرار بدهد. بنابراین برای خرید آنتی بادی باید دقیقا بدانید هدف شما کدام تکنیک است: وسترن بلات، فلوسایتومتری یا ایمونوهیستوشیمی. سه کلیدواژه اصلی شما هم دقیقا همینجا به شکل طبیعی وارد متن میشوند: خرید آنتی بادی وسترن بلات، خرید آنتی بادی فلوسایتومتری، خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی.

آنتی بادی مناسب برای وسترن بلات (Western Blot)

در وسترن بلات، پروتئین ها معمولا دناتوره میشوند (SDS و حرارت) و روی غشاء (PVDF یا نیتروسلولز) منتقل میشوند. پس آنتی بادی باید بتواند اپی توپ خطی (Linear epitope) را تشخیص دهد.

قبل از خرید آنتی بادی وسترن بلات این موارد را چک کنید

• کاربرد WB باید در دیتاشیت به صورت validated ذکر شده باشد، نه فقط listed.
• وزن مولکولی هدف (Expected band size) و نمونه های تست شده در دیتاشیت را بررسی کنید.
• گونه نمونه (Human/Mouse/Rat و…) باید با Reactivity آنتی بادی همخوان باشد.
• اگر پروتئین شما فسفریله یا تغییر یافته است، باید نسخه اختصاصی همان تغییر را بگیرید (مثل phospho-specific).

خطاهای رایج در WB که به آنتی بادی مربوط است

• باندهای اضافه: اختصاصیت پایین، یا رقت خیلی زیاد آنتی بادی، یا بلوک و شستشوی نامناسب.
• باند هدف دیده نمیشود: آنتی بادی برای WB ولیدیت نشده، اپی توپ در دناتوراسیون از بین رفته، یا مقدار پروتئین کم است.

آنتی بادی مناسب برای فلوسایتومتری

در فلوسایتومتری، آنتی بادی معمولا به پروتئین های سطحی یا داخل سلولی در حالت نزدیک به طبیعی متصل میشود. پس اپی توپ میتواند کانفورماسیونی باشد و شرایط آماده سازی نمونه (زنده، فیکس، پرمئابیلیزه) تعیین کننده است. اینجا انتخاب کلون و فلوروکروم از خود نام پروتئین هم مهم تر میشود.

قبل از خرید آنتی بادی فلوسایتومتری این موارد را چک کنید

• آنتی بادی باید Flow validated باشد.

• کلون (Clone) را جدی بگیرید. دو آنتی بادی علیه یک مارکر ممکن است کلون های متفاوت داشته باشند و شدت سیگنال و اختصاصیتشان فرق کند.

• اگر نمونه را فیکس میکنید، در دیتاشیت باید سازگاری با fixation/permeabilization ذکر شده باشد.

• فلوروکروم را بر اساس دستگاه و پنل انتخاب کنید (بهتر است متناسب با کانال ها و میزان بیان مارکر باشد).

• کنترل ها را از ابتدا در نظر بگیرید: Isotype control، FMO، و در برخی پنل ها بلاک Fc.

خطاهای رایج در Flow که به انتخاب آنتی بادی برمیگردد

• سیگنال ضعیف: فلوروکروم کم نور، یا کلون ضعیف برای آن گونه/نمونه، یا ناسازگاری با فیکساسیون.
• همپوشانی طیفی شدید: انتخاب بد فلوروکروم ها و نبود compensation درست.
• بک گراند بالا: اتصال غیر اختصاصی به Fc receptor، یا عدم استفاده از بلاک و شستشوی کافی.

آنتی بادی مناسب برای ایمونوهیستوشیمی (IHC)

در ایمونوهیستوشیمی، بافت معمولا فیکس شده (اغلب فرمالین) و ممکن است پارافینه باشد. فیکساسیون میتواند اپی توپ را ماسک کند، بنابراین بازیابی آنتی ژن (Antigen retrieval) نقش کلیدی دارد. این تکنیک به شدت به بک گراند حساس است، چون بافت ذاتا پروتئین های متنوع و محل های اتصال غیر اختصاصی زیادی دارد.

قبل از خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی این موارد را چک کنید:

• IHC validated باشد و ترجیحا نمونه های بافتی واقعی در دیتاشیت نشان داده شده باشد.
• نوع نمونه: FFPE یا Frozen. آنتی بادی باید برای همان نوع ولیدیت شده باشد.
• شرایط پیشنهادی بازیابی آنتی ژن (HIER با buffer مناسب یا enzymatic retrieval) را ببینید.
• نوع detection (HRP/DAB یا فلورسانس) و میزان بک گراند محتمل را در نظر بگیرید.
• اگر هدف شما مارکر هسته ای یا غشایی است، انتظار الگوی رنگ آمیزی باید مشخص باشد.

خطاهای رایج در IHC

• بک گراند بالا: بازیابی شدید، بلوک ناکافی، یا آنتی بادی با اختصاصیت پایین.
• سیگنال ضعیف: بازیابی آنتی ژن نامناسب، رقت زیاد، یا ناسازگاری آنتی بادی با FFPE.
• رنگ آمیزی غیرمنتظره: cross-reactivity یا تفسیر غلط الگوی رنگ آمیزی.

نگهداری و حمل و نقل آنتی بادی: اشتباهات رایج

بعد از خرید آنتی بادی، اگر نگهداری درست نباشد، حتی بهترین آنتی بادی هم به مرور ضعیف میشود یا بک گراندش بالا میرود. نکته مهم این است که خراب شدن آنتی بادی همیشه واضح نیست؛ یعنی ممکن است شما فکر کنید مشکل از پروتکل است، در حالی که آنتی بادی به دلیل نگهداری یا حمل نامناسب کیفیتش افت کرده است. این بخش مخصوصا برای شرایط واقعی آزمایشگاه ها مهم است که رفت و آمد نمونه ها، قطع برق، فریزرهای شلوغ، و باز و بسته شدن مکرر درب یخچال رایج است.

آنتی بادی ها معمولا در چه شرایطی عرضه میشوند؟

آنتی بادی های تحقیقاتی معمولا یکی از این حالت ها هستند:

• محلول آماده (liquid) با بافر نگهدارنده و گاهی محافظ (مثل sodium azide)
• لیوفیلیزه (خشک) که باید با بافر مناسب بازسازی شود
• کانژوگه شده (فلورسانت یا HRP) که معمولا حساس تر است.

روی برگه محصول یا دیتاشیت معمولا دمای پیشنهادی نگهداری ذکر میشود. اصل کلی این است: هرچه آنتی بادی حساس تر و کانژوگه تر باشد، مدیریت نگهداری مهم تر میشود.

بزرگترین دشمن آنتی بادی: فریز و دیفریز تکراری

بسیاری از آنتی بادی ها با چند بار فریز/دیفریز افت فعالیت پیدا میکنند یا پروتئینشان دچار aggregation میشود. نتیجه میتواند این باشد:

• سیگنال ضعیف تر از قبل
• افزایش اتصال غیر اختصاصی و بک گراند
• تغییر رفتار از یک سری آزمایش به سری دیگر

راه حل عملی

• بلافاصله بعد از خرید آنتی بادی، آن را در حجم های کوچک (aliquot) تقسیم کنید.
• از هر aliquot فقط برای چند بار استفاده کنید و دوباره فریز/دیفریز نکنید.
• اگر آنتی بادی فقط برای مدت کوتاه استفاده میشود، بخشی را در 4 درجه نگه دارید و بخش اصلی را فریز کنید (طبق توصیه دیتاشیت).

نگهداری در 4 درجه یا منفی 20؟ کدام بهتر است؟

این سوال یکی از پرتکرارترین ها بعد از خرید آنتی بادی است و پاسخ وابسته به فرمولاسیون است.

• اگر دیتاشیت گفته فقط 4 درجه: همان را رعایت کنید، چون برخی آنتی بادی ها با فریز شدن رسوب میکنند.
• اگر دیتاشیت اجازه داده منفی 20: برای نگهداری طولانی مدت بهتر است -20 باشد، اما با aliquot و جلوگیری از دیفریز تکراری.
• آنتی بادی های فلورسانت (برای خرید آنتی بادی فلوسایتومتری) معمولا باید از نور محافظت شوند و در 4 درجه یا طبق توصیه سازنده نگهداری شوند. بسیاری از آنها با فریز کردن افت میکنند یا فلوروکروم آسیب میبیند.

نکته مهم
فریزر -20 که زیاد باز و بسته میشود یا دما نوسان دارد، میتواند بدتر از یخچال پایدار باشد. در آزمایشگاه های شلوغ، ثبات دما مهم تر از عدد اسمی دماست.

محافظ ها و مواد افزودنی

بعضی آنتی بادی ها حاوی sodium azide هستند تا جلوی رشد میکروبی گرفته شود.

نکته مهم و کاربردی

• آنتی بادی های دارای azide برای کاربردهای زنده در فلوسایتومتری یا کشت سلولی مناسب نیستند، چون azide میتواند به سلول آسیب بزند.پس اگر خرید آنتی بادی فلوسایتومتری برای staining سلول زنده دارید، حتما به این مورد توجه کنید.

سوالات پرتکرار (FAQ)

1) برای خرید آنتی بادی از کجا بفهمم واقعا برای کار من مناسب است؟

بهترین معیار این است که در دیتاشیت، همان کاربرد موردنظر شما به صورت validated آمده باشد و تصویر واقعی همان تست وجود داشته باشد. اگر هدف شما وسترن بلات است باید تصویر WB با وزن مولکولی درست ببینید، اگر فلوسایتومتری است باید نمودار Flow و اطلاعات کلون و فلوروکروم باشد، و اگر ایمونوهیستوشیمی است باید تصویر بافت واقعی و نوع نمونه (FFPE یا Frozen) و شرایط antigen retrieval ذکر شده باشد.

2) خرید آنتی بادی وسترن بلات را بر چه اساس انجام بدهم تا باند اضافه نگیرم؟

اول مطمئن شوید آنتی بادی برای WB validated است و اپی توپ آن برای شرایط دناتوره مناسب است. بعد از خرید، رقت سریالی انجام دهید و به جای غلیظ کردن آنتی بادی، رقت را بالا ببرید و زمان انکوبیشن را در 4 درجه طولانی تر کنید. اگر بک گراند بالا است، ثانویه HRP را هم رقیق تر کنید و بلوکر را بین BSA و شیر تست کنید.

3) خرید آنتی بادی فلوسایتومتری را چگونه انجام بدهم که سیگنال ضعیف نشود؟

در فلوسایتومتری، کلون و فلوروکروم تعیین کننده هستند. باید آنتی بادی Flow validated باشد، کلون مشخص داشته باشد و فلوروکروم با میزان بیان مارکر و کانال های دستگاه سازگار باشد. اگر مارکر کم بیان است، PE یا APC معمولا انتخاب بهتر از FITC است. همچنین اگر نمونه را فیکس یا پرمئابیلیزه میکنید، باید در دیتاشیت سازگاری با fixation/permeabilization ذکر شده باشد.

4) خرید آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی چه تفاوتی با خرید برای وسترن بلات دارد؟

در ایمونوهیستوشیمی، آنتی ژن داخل بافت فیکس شده قرار دارد و ممکن است اپی توپ ماسک شود، بنابراین آنتی بادی باید برای IHC روی بافت واقعی validated شده باشد و نوع نمونه (FFPE یا Frozen) مشخص باشد. در WB پروتئین دناتوره است و آنتی بادی باید اپی توپ خطی را بشناسد. به همین دلیل یک آنتی بادی ممکن است در WB عالی باشد اما در IHC ضعیف عمل کند.

5) خرید آنتی بادی مونوکلونال بهتر است یا پلی کلونال؟

اگر تکرارپذیری و داده تمیز برای مقاله یا پایان نامه مهم است، خرید آنتی بادی مونوکلونال معمولا انتخاب امن تری است چون به یک اپی توپ مشخص میچسبد و بین بچ ها پایدارتر است. پلی کلونال میتواند سیگنال قوی تری بدهد، اما احتمال بک گراند و تفاوت بین سری تولید بیشتر است. انتخاب نهایی باید بر اساس ولیدیشن همان تکنیک باشد.

6) خرید آنتی بادی ثانویه را چطور بدون اشتباه انجام بدهم؟

ثانویه باید ضد گونه ای باشد که آنتی بادی اولیه در آن ساخته شده است، نه ضد گونه نمونه. مثلا اگر اولیه rabbit است، باید anti-rabbit بگیرید. سپس کانژوگه را بر اساس تکنیک انتخاب کنید: HRP برای WB/IHC و فلوروکروم برای IF/Flow. اگر نمونه انسانی یا چند رنگ دارید، بهتر است ثانویه cross-adsorbed انتخاب شود تا بک گراند کم شود.

7) چرا با اینکه خرید آنتی بادی درست بوده، در آزمایش سیگنال ندارم؟

دلایل رایج شامل این موارد است: گونه نمونه با reactivity آنتی بادی سازگار نیست، آنتی بادی برای آن تکنیک validated نشده، رقت خیلی زیاد است، شرایط نمونه سازی نامناسب است (مثلا پروتئین تخریب شده)، یا ثانویه اشتباه انتخاب شده است. بهترین تست سریع این است که کنترل مثبت واقعی و کنترل No primary را اجرا کنید.

8) چرا بعد از خرید آنتی بادی، در دفعات بعدی نتیجه بدتر میشود؟

شایع ترین علت فریز و دیفریز تکراری یا نگهداری نامناسب است. آنتی بادی ها باید aliquot شوند و از نور (برای فلورسانت ها) محافظت شوند. همچنین نوسان دما در فریزر یا یخچال شلوغ میتواند کیفیت را کم کند.

9) چرا برای فلوسایتومتری بهتر است آنتی بادی کانژوگه بخرم؟

برای خرید آنتی بادی فلوسایتومتری، معمولا انتخاب بهتر آنتی بادی های conjugated است چون استفاده از ثانویه فلورسانت میتواند بک گراند را بالا ببرد و گیتینگ را سخت کند. فقط در موارد خاص مثل تقویت سیگنال یا کمبود گزینه های کانژوگه، سراغ unconjugated و ثانویه میرویم.

10) آیا میتوانم از یک آنتی بادی برای چند تکنیک استفاده کنم؟

گاهی بله، اما فقط وقتی دیتاشیت نشان داده باشد که برای هر تکنیک validated است. اگر صرفا نوشته شده باشد WB/Flow/IHC بدون داده، ریسک بالاست. بهترین رویکرد این است که برای هر تکنیک، آنتی بادی validated همان تکنیک را تهیه کنید، مخصوصا برای IHC و Flow که حساس تر هستند.

11) در خرید آنتی بادی وسترن بلات، ثانویه HRP بهتر است یا فلورسانس؟

برای کاربردهای معمول، HRP با ECL رایج تر و اقتصادی تر است. اگر نیاز به multiplex، محدوده دینامیکی بالاتر یا کمیت دقیق تر دارید، سیستم های فلورسانس مزیت دارند. انتخاب به هدف پروژه و تجهیزات آزمایشگاه بستگی دارد.

12) چطور بفهمم بک گراند مربوط به اولیه است یا ثانویه؟

کنترل No primary بهترین راه است. اگر بدون اولیه هم سیگنال دارید، مشکل از ثانویه، بلوک، یا سیستم آشکارسازی است. اگر بدون اولیه سیگنال ندارید اما با اولیه بک گراند بالا است، باید رقت اولیه، بلوک و شرایط شستشو را اصلاح کنید.