چرا استخراج DNA از بافت پارافینه اهمیت دارد؟
استخراج DNA از بافت پارافینه یکی از روش های کاربردی در مطالعات ژنتیکی و تشخیص های مولکولی است که به پژوهشگران اجازه می دهد از نمونه های قدیمی و آرشیوی نیز اطلاعات ژنتیکی ارزشمند استخراج کنند. در آزمایشگاه های پاتولوژی، بافت های بیولوژیکی اغلب پس از تثبیت در فرمالین و قالب گیری در پارافین، به صورت اسلایدهای FFPE نگهداری می شوند. این نمونه ها منبع بسیار غنی و در دسترسی برای بررسی های ژنتیکی به شمار می روند، به ویژه در پروژه هایی که امکان تهیه نمونه تازه وجود ندارد.
با این حال، استخراج DNA از بافت پارافینه با چالش های خاصی مواجه است. فرمالین موجب ایجاد پیوند های عرضی بین DNA و پروتئین ها می شود و همین موضوع می تواند خلوص و یکپارچگی DNA را کاهش دهد. علاوه بر این، وجود پارافین مانع دسترسی کامل به مواد ژنتیکی شده و نیاز به مرحله زدایی دقیق و کنترل شده دارد.
امروزه با استفاده از کیت استخراج DNA از بافت پارافینه که توسط برند های مختلف داخلی و خارجی تولید می شوند، امکان استخراج DNA با کیفیت و خلوص مناسب فراهم شده است. این DNA قابلیت استفاده در تکنیک هایی مانند PCR، ریل تایم PCR و توالی یابی را دارد.
در این مقاله، به بررسی مراحل استخراج، معرفی کیت های پرکاربرد، نکات مهم برای افزایش بازده و مقایسه روش های مختلف پرداخته ایم تا راهنمایی کامل برای پژوهشگران حوزه ژنتیک و آسیب شناسی فراهم شود.
چالش های استخراج DNA از بافت پارافینه
استخراج DNA از بافت پارافینه نسبت به استخراج از نمونه های تازه یا خون، با موانع فنی خاصی همراه است که اگر به درستی مدیریت نشوند، باعث کاهش کیفیت، کمیت یا حتی تخریب کامل DNA می شوند. شناخت این چالش ها به انتخاب روش مناسب و افزایش بازده در آزمایشگاه کمک می کند.
یکی از مهم ترین چالش ها، تثبیت اولیه بافت در فرمالین است. این فرآیند موجب ایجاد پیوندهای عرضی (کراس لینک) بین مولکول های DNA و پروتئین ها می شود. این پیوندها نه تنها دسترسی آنزیم ها به DNA را محدود می کنند، بلکه باعث شکستن یا تغییر ساختار آن نیز می شوند. همین موضوع می تواند مانع از عملکرد صحیح تکنیک هایی مانند PCR یا تعیین توالی ژن شود.
عامل مهم دیگر، وجود پارافین در نمونه است. تا زمانی که پارافین به طور کامل از بافت خارج نشود، دسترسی شیمیایی به DNA ممکن نیست. زدایش ناقص پارافین موجب انسداد ستون استخراج، کاهش بازده، یا آلودگی نهایی DNA خواهد شد.
زمان نگهداری نمونه نیز در کیفیت DNA تأثیرگذار است. نمونه های پارافینه قدیمی تر معمولاً دارای DNA تکه تکه شده و آسیب دیده تری هستند. این موضوع مخصوصاً برای تکنیک های حساس و با نیاز به DNA سالم مانند کلونینگ یا توالی یابی کامل ژن، مشکل ساز می شود.
استفاده از کیت استخراج DNA از بافت پارافینه که با فرمولاسیون های ویژه طراحی شدهاند، می تواند تا حد زیادی این چالش ها را کاهش دهد. این کیت ها معمولاً شامل ترکیباتی برای حذف مؤثر پارافین، شکستن پیوند های پروتئینی، و بازیابی DNA با خلوص بالا هستند.
مراحل استخراج DNA از بافت پارافینه
استخراج DNA از بافت پارافینه فرآیندی دقیق و چندمرحله ای است که برای موفقیت آن باید به ترتیب مراحل، دما، زمان های انکوباسیون و ترکیب بافر ها توجه ویژه داشت. در این بخش، مراحل رایج استخراج به زبان ساده و کاربردی توضیح داده می شود، طوری که هم برای کاربران تازه کار و هم متخصصین قابل استفاده باشد. این مراحل معمولاً با یا بدون کیت استخراج DNA از بافت پارافینه انجام می شود، اما کیت های تجاری اغلب باعث تسریع و افزایش کیفیت استخراج می شوند.
| مرحله | توضیح |
|---|---|
| برش زدن نمونه بافت پارافینه | با استفاده از میکروتوم، برش هایی با ضخامت 5 تا 10 میکرون تهیه می شود. ضخامت کمتر باعث افزایش بازده استخراج می شود. |
| دبلاکینگ یا زدایش پارافین | پارافین با زایلن یا هگزان حذف شده و نمونه با الکل 100٪ شسته می شود تا حلال آلی نیز کاملاً خارج شود. |
| بازگرداندن نمونه به شرایط آبی | نمونه به ترتیب با اتانول 95٪، 70٪ و سپس آب مقطر شست و شو می شود تا برای لیز آماده باشد. |
| لیز سلولی و هضم بافت | بافت در بافر حاوی SDS و پروتئیناز K در دمای 56 درجه سانتی گراد هضم می شود تا DNA آزاد شود. |
| غیرفعال سازی پروتئیناز K | با افزایش دما به 80 تا 90 درجه، پروتئیناز K غیرفعال می شود تا در مراحل بعدی تداخل ایجاد نکند. |
| استخراج و خالص سازی DNA | DNA با روش رسوب دهی با الکل یا به کمک ستون های سیلیکا (در کیت ها) استخراج می شود. |
| شست و شو و بازیابی DNA | DNA خالص شده با بافر شست و شو تمیز شده و سپس با آب یا بافر TE جمع آوری می شود. |
| اندازه گیری کمیت و کیفیت DNA | مقدار و خلوص DNA با نانودراپ یا ژل الکتروفورز بررسی می شود. نسبت A260/A280 بین 1.7 تا 2.0 نشان دهنده کیفیت مناسب است. |
مقایسه روش های استخراج DNA از بافت پارافینه
برای استخراج DNA از بافت پارافینه (FFPE)، دو روش اصلی وجود دارد که در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرد: روش رسوبی سنتی و روش ستونی با استفاده از کیت استخراج DNA از بافت پارافینه. انتخاب بین این دو روش بسته به هدف آزمایش، امکانات موجود و میزان خلوص و بازده مورد نظر انجام می شود.
| ویژگی | روش رسوبی (الکل/فنل) | روش ستونی با کیت استخراج DNA از بافت پارافینه |
|---|---|---|
| بازده | بالا، اما با احتمال ناخالصی | متوسط تا بالا، خالص و آماده استفاده |
| کیفیت DNA | گاهی حاوی پروتئین یا RNA باقیمانده | خلوص بالا، قابل استفاده مستقیم در PCR |
| زمان انجام | طولانی (3 تا 5 ساعت) | کوتاه تر (کمتر از 2 ساعت) |
| سهولت اجرا | نیاز به مهارت بالا و دقت زیاد | ساده و قابل اجرا برای کاربران مبتدی |
| مواد شیمیایی مورد استفاده | سمی (فنل، کلروفرم، الکل) | غیر اسیدی و بی خطرتر |
| هزینه | پایین تر | بالاتر، ولی همراه با کیت آماده و سریع |
برند های معتبر کیت استخراج DNA از بافت پارافینه
برای ساده سازی فرآیند استخراج DNA از بافت پارافینه و افزایش کیفیت خروجی، استفاده از کیت های تجاری گزینه ای مطمئن، سریع و قابل اطمینان است. این کیت ها معمولاً شامل بافر های مخصوص، ستون های سیلیکا یا فرمول های رسوب دهی ایمن و مواد لازم برای حذف پارافین، لیز سلولی، خالص سازی و بازیابی DNA هستند.
در ادامه، برندهای معتبر خارجی و داخلی در حوزه تولید کیت استخراج DNA از بافت پارافینه معرفی شده اند:
برند های خارجی
- Qiagen (آلمان): یکی از محبوب ترین برندها در دنیا، کیت QIAamp DNA FFPE Tissue Kit از این شرکت بازده بالا و خلوص قابل اطمینانی ارائه می دهد. مناسب برای PCR، real-time PCR و NGS.
- Zymo Research (آمریکا): کیت ZR FFPE DNA MiniPrep مناسب برای نمونه های آرشیوی با DNA آسیب دیده است. خلوص بالا و بدون نیاز به فنل یا کلروفرم.
- Thermo Fisher Scientific: کیت های GeneJET و MagJET از این برند برای استخراج DNA از بافت های فیکس شده در فرمالین طراحی شدهاند و با فرمت های مگنتیک و ستونی ارائه می شوند.
- Macherey-Nagel (آلمان): کیت NucleoSpin DNA FFPE مناسب برای استفاده در پروژه های حساس مانند توالییابی و بررسی جهش ها.
برند های ایرانی
- کارمانیا پارس ژن: کیت های FFPE این شرکت برای استفاده در مطالعات بالینی و پژوهشی طراحی شدهاند و با پروتکل های ساده شده، استخراج را تسریع می کنند.
- یکتا تجهیز آزما: این شرکت نیز کیت های متنوعی برای استخراج DNA از منابع مختلف، از جمله بافت پارافینه، تولید می کند و در حال حاضر مورد استفاده برخی مراکز تحقیقاتی قرار گرفته است.
استخراج DNA از بافت پارافینه یکی از مراحل کلیدی در پژوهش های مولکولی، ژنتیکی و تشخیص های پاتولوژیک است. بافت های فیکس شده در فرمالین و جاسازی شده در پارافین (FFPE)، به عنوان منابع آرشیوی ارزشمندی برای مطالعات گذشته نگر (retrospective) شناخته می شوند. اما بازیابی DNA از این نمونه ها به دلیل ایجاد پیوندهای عرضی، تکه تکه شدن DNA، و وجود پارافین، چالش برانگیز است.
در این مقاله، مراحل گام به گام استخراج، مقایسه روش های رایج (ستونی و رسوبی)، معرفی برندهای مطرح و همچنین نکات فنی برای افزایش کیفیت DNA بررسی شد. استفاده از کیت استخراج DNA از بافت پارافینه باعث افزایش سرعت، دقت، و خلوص نهایی نمونه می شود و برای بسیاری از کاربردهای حساس مانند PCR، Real-Time PCR و حتی NGS گزینه ای قابل اطمینان است.
در نهایت، موفقیت در استخراج به ترکیبی از رعایت دقیق پروتکل ها، کیفیت مواد مصرفی، انتخاب کیت مناسب، و تجربه اپراتور بستگی دارد. اگر در حال انجام پروژه ای با نمونه های FFPE هستید، حتماً در انتخاب روش و کیت، نیازهای نهایی تحقیق را در نظر بگیرید و از مشاوره کارشناسان بهره ببرید.
بایوتکنولب